乙醛脫氫酶（ALDH）測試盒

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義

乙醛脫氫酶 (EC 1.2.1.10)是醛脫氫酶的一種，廣泛存在于各種動物、植物和微生物體內。主要作用是將乙醛氧化成乙酸，在酒精代謝中起主要作用。在人類和許多動物體內，線粒體乙醛脫氫酶能把對生物體有害的醇類轉化，所以在細胞解毒研究中乙醛脫氫酶受到高度關注；同時，乙醛脫氫酶在分子生物學以及相關疾病的檢測方面有較廣泛的研究應用。

測定原理

在輔酶Ⅰ存在的條件下，乙醛脫氫酶催化乙醛和NAD+轉化為乙酸和NADH，在340nm處的吸光值會增加，測定340nm處的吸光值變化，可計算得到乙醛脫氫酶的活性。

自備實驗用品及儀器

天平、離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。

試劑組成和配制

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體6mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體1mL×1支，4℃避光保存。

試劑四：液體1mL×1支，4℃保存。

試劑五：液體1mL×1支，4℃保存。

ALDH提取

1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心20min。

2. 細胞：按照細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 液體：直接檢測。

測定操作表

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min，調節(jié)波長至340nm。

2. 操作表

ALDH酶活計算

1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

ALDH酶活（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T = 804×△A÷Cpr

（2）按樣本質量計算

酶活定義：每克樣品每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

ALDH酶活（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 804×△A÷W

（3）按照細胞數(shù)量計算

酶活定義：每104個細胞每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

ALDH酶活（nmol/min/104cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數(shù)量（萬個））÷T= 804×△A÷細胞數(shù)量（萬個）

（4）按液體體積計算

酶活定義：每mL樣本每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

ALDH酶活（nmol/min/mL）= ×V反總÷V樣÷T= 804×△A

：NADH微摩爾消光系數(shù)，6.22×10-3 L/µmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，0.2mL；V樣：反應體系中樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g

b．用96孔板測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

ALDH酶活（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Crp）÷T = 1608×△A÷Cpr

（2）按樣本質量計算

酶活定義：每克樣品每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

ALDH酶活（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T = 1608×△A÷W

（3）按照細胞數(shù)量計算

酶活定義：每104個細胞每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

ALDH酶活（nmol/min/104cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數(shù)量（萬個））÷T= 1608×△A÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

酶活定義：每mL樣本每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

ALDH酶活（nmol/min/mL）= ×V反總÷V樣÷T= 1608×△A

：NADH微摩爾消光系數(shù)，6.22×10-3 L/µmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應體系總體積，0.2mL；V樣：反應體系中樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g

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