裂解緩沖液：

為了準(zhǔn)備在凝膠上運(yùn)行的樣品，需要裂解細(xì)胞和組織以釋放感興趣的蛋白質(zhì)。這會(huì)溶解蛋白質(zhì)，使它們可以單獨(dú)遷移通過(guò)分離凝膠。我們使用 RIPA 緩沖液 (beyotime P0013B) 來(lái)提取全細(xì)胞提取物和膜結(jié)合蛋白。

蛋白酶和磷酸酶抑制劑：

一旦發(fā)生裂解，蛋白水解、去磷酸化和變性就開(kāi)始。如果樣品始終保存在冰上或 4°C 下，并且將適當(dāng)?shù)囊种苿┬迈r添加到裂解緩沖液中，這些事件可以大大減慢。 Pmsf是我們經(jīng)常使用的蛋白酶抑制劑。

組織裂解液的制備

用干凈的工具解剖感興趣的組織，最好在冰上，并盡可能快地防止蛋白酶降解。均質(zhì)化前應(yīng)將 RIPA（含 1mM pmsf）冰冷。

將組織切成小片，對(duì)于約 20 mg 的組織，將約 250 μl 裂解緩沖液快速加入管中，用電動(dòng)勻漿器（或玻璃勻漿器）勻漿直至全裂解。

在微量離心機(jī)中于 4°C 下以 10000~14000g 離心 5 分鐘。輕輕地從離心機(jī)中取出管子并置于冰上，吸出上清液并置于冰上保存的新管中；丟棄顆粒。

蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定：

使用 PAGE 凝膠、Bradford 測(cè)定、Lowry 測(cè)定或 BCA 測(cè)定。牛血清白蛋白（BSA）是一種常用的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。

制備用于加載到凝膠中的樣品：

要變性，請(qǐng)使用帶有陰離子變性去污劑十二烷基* (SDS) 的上樣緩沖液，并將混合物在 95-100°C 下煮沸 5 分鐘。

1. 清潔玻璃并設(shè)置電泳系統(tǒng)。

2. 制備PAGE膠，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量選擇不同濃度的分離膠：

1. 4%堆積膠，選擇預(yù)染色的蛋白質(zhì)Marker Proteins的大小，以幫助區(qū)分蛋白質(zhì)大小和電泳示蹤劑。

2. 上樣跑膠，每孔加樣量20-40μg蛋白，加樣時(shí)注意不要溢出到相鄰孔中，造成膠戳孔和交叉污染。

3. 按照電泳方法推薦的說(shuō)明進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)將凝膠耗盡時(shí)終止凝膠電泳。

1. 將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。 （根據(jù)trans-blot系統(tǒng)推薦的說(shuō)明。）

2. 查看膜中的蛋白質(zhì)：麗春紅。轉(zhuǎn)印后，用麗春紅染料染色約2～5min，檢查轉(zhuǎn)印是否成功。然后用蒸餾水沖洗掉染料。

3. 封閉膜一般用5%脫脂牛奶，或3%~5% BSA。 4 ℃搖床振蕩封閉過(guò)夜，或37 ℃封閉2小時(shí)。封閉后TBS洗滌5-10秒。 

4. 與一抗一起孵育。按照推薦的抗體稀釋度，用TBST（或1%~3%脫脂牛奶）稀釋抗體。然后將膜裝入自封袋和固定層壓機(jī)中，將抗體溶液添加到自封袋中，并確保膜與足夠體積的抗體一起孵育。

5. 37℃振蕩孵育1～3 h（根據(jù)抗體效價(jià)和親和力），或4℃過(guò)夜孵育，TBST室溫?fù)u床上洗3次，每次5～10 min。

6. 與二抗孵育，同步驟(4)，用TBST稀釋?zhuān)?7℃振蕩孵育1～3 h。

HRP 偶聯(lián)抗體的化學(xué)發(fā)光、顯影和固定：ECL 是使用的傳統(tǒng)試劑盒。

在暗室中，將顯影劑和固定劑分別裝入塑料托盤(pán)中，在離心管中混合兩種試劑（A 和 B 的體積）。確保膜表面蛋白與混合物充分接觸。 1~2分鐘后去除殘留物。

紅燈處取出膠片，打開(kāi)膠片夾，將膠片放在膠片上，取下膠片夾，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度調(diào)整曝光時(shí)間，記住曝光過(guò)度的膠片不適合分析。

曝光完成后，取出膠片，迅速浸入顯影液中，終止顯影。顯影后，應(yīng)立即將膠片浸入定影液中成透明膜。用自來(lái)水清洗除去殘留的固定劑后，在室溫下干燥。