介紹

體外 轉染過程 涉及將遺傳物質引入細胞，通常通過非病毒方法用于哺乳動物細胞 [1]。各種治療性貨物分子可用于細胞內遞送至癌細胞系和原代細胞，包括質粒 DNA (pDNA)、蛋白質、小分子、信使 RNA (mRNA) 和RNA，例如短干擾 RNA ( siRNA ) 和微小 RNA (miRNA) ) [2]。Altogen Biosystems 通過將組合化學、分子生物學和細胞生物學方面的專業(yè)知識應用于轉染技術的開發(fā)，為特定細胞系開發(fā)優(yōu)化的轉染技術。

自 1950 年代以來，轉染一直在使用，并且仍然是細胞生物學研究中的重要元素，其技術范圍從物理技術（如電穿孔）到使用磷酸鈣的化學介導轉染，甚至脂質體轉染技術 [3]。在脂質體轉染中，遺傳物質包含在脂質體中通過將材料與陽離子脂質混合，脂質體將其“貨物"沉積到靶細胞中。可以針對目標細胞系優(yōu)化轉染試劑，也可以定制轉染方案。最近出現(xiàn)了幾種先進的方法，例如基于脂質和聚合物的載體分子。這些化合物能夠產生脂質體，脂質體可以與細胞膜融合，以便將結合的 RNA 或 DNA 遞送至細胞。

轉染：作用機制

體外 轉染是將外源分子和遺傳物質、DNA或 RNA 瞬時或穩(wěn)定地引入培養(yǎng)的哺乳動物細胞中。盡管轉染技術存在方法學多樣性，但化學轉染是當前實驗室研究中使用的技術。使用的轉染試劑含有陽離子脂質，有助于將 DNA 和 siRNA 遞送到細胞中 [4]；雖然陽離子聚合物是最早使用的化學品之一，但陽離子脂質現(xiàn)在是當今使用廣泛的化學品。化學轉染背后的科學原理保持不變，它基于載貨分子與細胞膜脂質雙層之間的靜電相互作用. 基本上，帶負電荷的遺傳物質與帶正電荷的試劑結合，使遺傳物質能夠穿過細胞膜，從而通過內吞作用發(fā)生細胞攝取。在細胞內部，轉染復合物可用于多種目的。如果 DNA 被轉染，則穩(wěn)定表達需要它進入細胞核，從而導致基因表達 [5]。可能影響特定化學選擇的因素取決于轉染的遺傳物質，但 pH 值、細胞類型以及遺傳物質與試劑的比例等因素對于正確的實驗設置至關重要。

轉染方法

將 DNA 和 RNA 引入培養(yǎng)的哺乳動物細胞可能需要不同的轉染方法，具體取決于特定的細胞系和最終目標。此類方法包括脂質體介導的轉染、非脂質體轉染劑（脂質和聚合物）、基于樹枝狀聚合物的轉染、電穿孔、顯微注射、病毒介導的基因遞送、RNA 干擾 (RNAi)、siRNA 轉染、高通量 siRNA 篩選和基因沉默 (RNAi) [6, 7, 8]。

轉染試劑

對于化學轉染實驗來說，保持細胞活力極為重要；如果細胞因用于轉染的有毒化學品而死亡，則實驗結束。轉染試劑之所以眾多，正是因為某些細胞類型需要更溫和的條件或特殊添加劑來防止細胞毒性。就此而言，Altogen Biosystems 提供了專為特定細胞系設計的種類齊全的試劑，專門設計用于提高轉染效率，同時防止細胞死亡。

轉染試劑本身由專門針對特定細胞類型優(yōu)化的緩沖液配方組成。在某些情況下，轉染試劑可包括旨在幫助所需化合物進入細胞的分子。例如，脂質體轉染試劑將包括脂質體鏈，其封裝給定的核酸序列并允許其被細胞內吞。另一個例子是用納米粒子制成的轉染試劑，它可以結合所需的序列并幫助它們穿過細胞膜。

與所需貨物結合的轉染試劑和影響細胞膜的轉染試劑之間應該有一個重要的區(qū)別。例如，電穿孔緩沖液是一種轉染試劑，它允許細胞膜變得可滲透，從而允許外來顆粒進入細胞。然而，電穿孔緩沖液不封裝核酸序列，因此電穿孔實驗必須依賴轉染化合物的獨立穩(wěn)定性。

體外 轉染研究

Altogen Biosystems 提供針對不同細胞系優(yōu)化的不同體外轉染試劑，例如 A549 細胞（肺癌）、DU145 細胞（前列腺癌）、MCF-7 細胞（乳腺癌）和 HepG2 細胞（肝細胞癌）。以下是使用  細胞系特異性體外轉染試劑進行的幾項研究的數(shù)據(jù)匯編。

A549細胞轉染試劑（肺癌細胞，CCL-185）

圖 1.按照推薦方案轉染靶向 Lamin A/C mRNA 或非沉默對照 siRNA 的 siRNA。在轉染后 48 小時，通過 qRT-PCR 分析 A549 細胞的基因表達水平。18S rRNA 水平用于標準化 Lamin A/C 數(shù)據(jù)。將值歸一化為未處理的樣品。數(shù)據(jù)為平均值±SD (n=3)。

• 雙組分制劑提高了脂質介導的轉染效率，

• 為 RNA 和 DNA 的轉染提供了優(yōu)化的易于使用的轉染方案

• 血清存在下的高轉染效率

• 適用于標準反向轉染和高通量應用。

• 試劑表現(xiàn)出至少 80% 的 siRNA 轉染效率。轉染效率通過實時RT-PCR確定。

圖 2. Lamin A/C 在 A549 細胞中的蛋白質表達。按照 Altogen Biosystems 轉染方案，將表達 Lamin A/C 或靶向 Lamin A/C 的 siRNA 的 DNA 質粒轉染到 A549 細胞中。在轉染后 72 小時，通過蛋白質印跡分析細胞的蛋白質表達水平（通過總蛋白質標準化，每孔加載 10 µg 總蛋白質）。未處理的細胞用作陰性對照。

DU145 細胞（前列腺癌細胞，HTB-81）轉染試劑

圖 3.按照推薦方案將靶向 Lamin A/C mRNA 或非沉默對照 siRNA 的 siRNA 轉染到 DU-145 細胞中。在轉染后 48 小時，通過 qRT-PCR 分析細胞的 Lamin A/C 基因表達水平。18S rRNA 水平用于標準化 Lamin A/C 數(shù)據(jù)。將值歸一化為未處理的樣品。數(shù)據(jù)為平均值±SD (n=4)。

• 專有陽離子脂質配方

• 小RNA（siRNA、shRNA、miRNA）、mRNA、pDNA的高轉染效率

• 產生一致的結果，批次到批次、板到板和孔到孔

• 一種經(jīng)過驗證的用于建立穩(wěn)定細胞系的試劑

• 優(yōu)化的轉染方案適用于標準和反向轉染方法。

• 有效且穩(wěn)健的細胞內遞送

• 試劑盒包括轉染增強劑試劑

• 在血清存在下工作

• 試劑表現(xiàn)出至少 75% 的 siRNA 轉染效率。通過 qRT-PCR 確定轉染效率。

圖 4. Lamin A/C 在 DU145 細胞中的蛋白質表達。按照 Altogen Biosystems 轉染方案，將表達 Lamin A/C 或靶向 Lamin A/C 的 siRNA 的 DNA 質粒轉染到 DU145 細胞中。在轉染后 72 小時，通過蛋白質印跡分析細胞的蛋白質表達水平（通過總蛋白質標準化，每孔加載 10 µg 總蛋白質）。未處理的細胞用作陰性對照。

MCF-7細胞轉染試劑（乳腺癌細胞，HTB-22）

圖 5 。在用靶向 GAPD 或非沉默 siRNA 的 siRNA 轉染的 MCF-7 細胞中，使用實時 RT-PCR 對 GAPD mRNA 水平進行量化。轉染后 48 小時，收獲細胞并通過實時 RT-PCR 分析 GAPDH mRNA 表達水平。數(shù)據(jù)針對 18S rRNA 信號進行標準化。對照樣品是模擬轉染的或未處理的。將值歸一化為未處理的樣品。數(shù)據(jù)為平均值±SD (n=3)。

• 專有陽離子脂質配方

• 小RNA（siRNA、shRNA、miRNA）、mRNA、pDNA的高轉染效率

• 產生一致的結果，批次到批次、板到板和孔到孔

• 在血清存在下工作

• 一種經(jīng)過驗證的用于建立穩(wěn)定細胞系的試劑

• 試劑表現(xiàn)出至少 85% 的 siRNA 轉染效率。通過 qRT-PCR 確定轉染效率。

圖 6. MCF-7 細胞中 GAPDH 的蛋白表達。按照 Altogen Biosystems 轉染方案，將表達 GAPDH 或靶向 GAPDH 的 siRNA 的 DNA 質粒轉染到 MCF-7 細胞中。在轉染后 72 小時，通過蛋白質印跡分析細胞的蛋白質表達水平（通過總蛋白質標準化，每孔加載 10 µg 總蛋白質）。未處理的細胞用作陰性對照。

HepG2細胞轉染試劑（肝癌細胞，HB-8065）

圖 7.在轉染了靶向 GAPD 或非沉默 siRNA 的 siRNA 的 HepG2 細胞中，使用實時 RT-PCR 對 GAPD mRNA 水平進行了定量。轉染后 48 小時，收獲細胞并通過實時 RT-PCR 分析 GAPDH mRNA 表達水平。數(shù)據(jù)針對 18S rRNA 信號進行標準化。對照樣品是模擬轉染的或未處理的。將值歸一化為未處理的樣品。數(shù)據(jù)為平均值±SD (n=3)。

• 小RNA（siRNA、shRNA、miRNA）、mRNA、pDNA的高轉染效率

• 有效且穩(wěn)健的細胞內遞送

• 產生一致的結果，批次到批次、板到板和孔到孔

• 在血清存在下工作

• 一種經(jīng)過驗證的用于建立穩(wěn)定細胞系的試劑

• 試劑表現(xiàn)出至少 90% 的 siRNA 轉染效率。通過 qRT-PCR 確定轉染效率。

圖 8. HepG2 細胞中 GAPDH 的蛋白表達。按照 Altogen Biosystems 轉染方案，將表達 GAPDH 或靶向 GAPDH 的 siRNA 的 DNA 質粒轉染到 HepG2 細胞中。在轉染后 72 小時，通過蛋白質印跡分析細胞的蛋白質表達水平（通過總蛋白質標準化，每孔加載 10 µg 總蛋白質）。未處理的細胞用作陰性對照。

結論：

轉染是一項經(jīng)過充分測試且至關重要的生物技術，它使研究人員能夠直接在細胞中研究基因產物和基因功能。不同的轉染方法允許以非常特定的方式傳遞遺傳物質，從而使其成為臨床前生物學研究中極其通用的工具。選擇最佳方法涉及實施最佳轉染試劑，以及選擇最佳實驗設計。

Altogen Biosystems 提供預優(yōu)化和細胞系特異性體外轉染試劑和試劑盒。在他們的網(wǎng)站上了解更多關于這些轉染試劑和試劑盒的信息，并加快您今天的臨床前生物學研究。